1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量測定 蛋白質(zhì)在普通聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度取決于蛋白質(zhì)分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少。SDS(十二烷基磺酸鈉)是一種去污劑,可使蛋白質(zhì)變性并解離成亞基。當?shù)鞍踪|(zhì)樣品中加入SDS后,SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合,使蛋白質(zhì)分子帶上大量的強負電荷,并且使蛋白質(zhì)分子的形狀都變成短棒狀,從而消除了蛋白質(zhì)分子之間原有的帶電荷量和分子形狀的差異。這樣電泳的速度只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小,蛋白質(zhì)分子在電泳中的相對遷移率和分子質(zhì)量的對數(shù)成直線關(guān)系。以標準蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和其相對遷移率作圖,得到標準曲線,根據(jù)所測樣品的相對遷移率,從標準曲線上便可查出其分子質(zhì)量。
2.沉降法(超速離心法)分子量測定 沉降系數(shù)(S)是指單位離心場強度溶質(zhì)的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心分離時,由于比重關(guān)系,蛋白質(zhì)分子趨于下沉,沉降速度與蛋白質(zhì)顆粒大小成正比,應(yīng)用光學(xué)方法觀察離心過程中蛋白質(zhì)顆粒的沉降行為,可判斷出蛋白質(zhì)的沉降速度。根據(jù)沉降速度可求出沉降系數(shù),將S帶入公式,即可計算出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。質(zhì)的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心分離時,由于比重關(guān)系,蛋白質(zhì)分子趨于下沉,沉降速度與蛋白質(zhì)顆粒大小成正比,應(yīng)用光學(xué)方法觀察離心過程中蛋白質(zhì)顆粒的沉降行為,可判斷出蛋白質(zhì)的沉降速度。根據(jù)沉降速度可求出沉降系數(shù),將S帶入公式,即可計算出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。
3.凝膠過濾法分子量測定 凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質(zhì)分子量范圍,在此范圍內(nèi),分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此,用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標準,進行凝膠層析,以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖,繪制出標準洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進行凝膠層析,根據(jù)其所用的洗脫體積,從標準洗脫曲線上可求出此未知蛋白質(zhì)對應(yīng)的分子量。
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