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文獻(xiàn)名：葉酸介導(dǎo)的復(fù)方多功能納米膠束的構(gòu)建及評(píng)價(jià)
作者：王飛虎（山東大學(xué)， 制藥工程， 2012， 碩士）
導(dǎo)師：張典瑞； 張強(qiáng)；
摘要：腫瘤多藥耐藥性系指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí),對(duì)其他許多結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物亦產(chǎn)生交叉抗藥性,它是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象。腫瘤MDR形成機(jī)制非常復(fù)雜,在已闡明的多種腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)理中,藥物外排泵蛋白P-糖蛋白(P-gp)在細(xì)胞膜上的過(guò)度表達(dá)是腫瘤MDR產(chǎn)生的主要原因。目前,針對(duì)P-gp耐藥蛋白和耐藥機(jī)制,腫瘤MDR的逆轉(zhuǎn)策略主要體現(xiàn)在采用載體給藥系統(tǒng)和多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑逆轉(zhuǎn)MDR。紫杉醇最早是新型抗腫瘤活性成分,主要用于治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌和乳腺癌。維拉帕米作為一種鈣離子通道阻滯劑,也是應(yīng)用最早的MDR逆轉(zhuǎn)劑。本實(shí)驗(yàn)中我們將維拉帕米和紫杉醇共同包載在DOMC-FA載體內(nèi)制備紫杉醇抗耐藥性主動(dòng)靶向制劑。首先,用脫氧膽酸疏水性修飾O-羧甲基殼聚糖,得到一種兩親性的聚合物,然后與葉酸偶聯(lián)開(kāi)發(fā)一種新型的具有潛在腫瘤靶向作用的藥物傳輸系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)紅外光譜法、核磁共振波譜法(氫譜)、X-射線衍射分析了聚合物的結(jié)構(gòu)特征。說(shuō)明脫氧膽酸和葉酸成功的接枝到O-羧甲基殼聚糖上。聚合物在水溶液中的自聚集的理化性質(zhì)通過(guò)核磁共振波譜法、粒徑測(cè)定、Zeta電勢(shì)、熒光色譜、透射電鏡方法得以研究。在pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液中,自聚集物的平均粒徑大小隨著脫氧膽酸取代度的增加而減小。DOMC和DOMC-FA自聚物的平均粒徑分別在231-383nm和179-212nm,并且具有窄的和單式的粒徑分布。自聚物的透射電鏡形態(tài)為球形的。自聚集體的Zeta電勢(shì)在-20mV左右,其表面被帶負(fù)電荷的O-羧甲基殼聚糖所覆蓋。聚合物的臨界角束濃度與脫氧膽酸的取代度有關(guān),其值比低分子量的表面活性劑稍低。DOMC的臨界角束濃度范圍為0.027-0.065mg/mL,DOMC-FA的臨界角束濃度值比DOMC7稍微小一些。聚合物的平均粒徑和臨界角束濃度值依賴于其取代度,并且隨著pH的變化而有所變化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)考查以自組裝法制備載藥納米膠束。制備的DOMC-FA/PTX納米膠束的載藥量為33.61%,包封率高達(dá)84.32%,膠束的平均粒徑為258.2nin,粒徑分布的范圍均較窄。用與載紫杉醇相似的工藝包載維拉帕米,DOMC-FA/VRP納米膠束的藥物和載體質(zhì)量選擇為15：25時(shí),其相應(yīng)的載藥量高達(dá)33.42%,包封率高達(dá)82.28%；DOMC-FA/(PTX+VRP)納米膠束中紫杉醇和維拉帕米的包封率依次為95.28%和71.15%,DOMC-FA/VRP膠束的平均粒徑為269.7nm,DOMC-FA/(PTX+VRP)膠束的平均粒徑為299.4nm,粒徑分布的范圍均較窄。所制備納米膠束的Zeta電勢(shì)值均為負(fù)值,大約-18mV,說(shuō)明納米膠束的表面被羧甲基殼聚糖帶負(fù)電的羧基所覆蓋。納米膠束室溫放置3個(gè)月后,其外觀、粒徑和包封率均無(wú)較大的改變；而在冷藏條件下放置6個(gè)月后,外觀、粒徑和包封率略有變化,但仍符合要求,說(shuō)明載藥納米膠束具有較好的穩(wěn)定性。體外釋放試驗(yàn)中,兩種DOMC/PTX和DOMC-FA/PTX納米膠束的累積釋藥曲線相似,與紫杉醇溶液的釋藥相比具有很明顯的緩釋作用。載藥的DOMC和DOMC-FA膠束是一種復(fù)雜體系,DOMC的消化和降解比較緩慢,因此藥物的釋放呈現(xiàn)緩釋行為。說(shuō)明這種膠束載體不僅增加了難溶性藥物的溶解度,而且持續(xù)控制藥物的釋放。DOMC-FA/VRP和DOMC-FA/(PTX+VRP)納米膠束中紫杉醇和維拉帕米的累積釋藥曲線相似,與其溶液的釋藥相比具有很明顯的緩釋作用。DOMC-FA/(PTX+VRP)中紫杉醇的釋藥速率較維拉帕米慢,但二者從DOMC-FA/(PTX+VRP)釋放出的分子摩爾比例仍然在1：250左右,不影響協(xié)同耐藥的逆轉(zhuǎn)效果,進(jìn)一步說(shuō)明DOMC-FA/(PTX+VRP)膠束能夠很好的控制釋放藥物達(dá)到腫瘤的有效治療。再者,藥物從膠束中的釋放呈現(xiàn)一定的pH依賴性。從而進(jìn)一步說(shuō)明,該納米膠束載體系統(tǒng)能夠在腫瘤部位釋放更多的藥物,在腫瘤的治愈方面有潛在的價(jià)值。為了研究葉酸靶向膠束被葉酸受體表達(dá)細(xì)胞的攝取,MCF-7細(xì)胞用游離羅丹明-123溶液、載羅丹明-123普通膠束(DOMC/R-123)、載羅丹明-123葉酸靶向膠束(DOMC-FA/R-123)培養(yǎng)不同的時(shí)間。結(jié)果表明,靶向DOMC-FA/R-123納米膠束攝取量增高是葉酸受體介導(dǎo)的胞吞作用的增強(qiáng)所致。游離葉酸可競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞對(duì)DOMC-FA/R-123納米膠束的攝取,說(shuō)明DOMC-FA/R-123納米膠束進(jìn)入細(xì)胞主要通過(guò)MCF-7細(xì)胞表面過(guò)渡表達(dá)的葉酸受體和靶向DOMC-FA膠束表面葉酸結(jié)合而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的內(nèi)攝作用。敏感MCF-7細(xì)胞的MTT試驗(yàn)、細(xì)胞形態(tài)觀察、凋亡試驗(yàn)證實(shí)葉酸修飾的膠束可通過(guò)葉酸介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)攝作用增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。載紫杉醇葉酸膠束(DOMC-FA/PTX)比紫杉醇普通膠束(DOMC/PTX)和市售紫杉醇制劑(Taxol注射液)顯示更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性作用。這些結(jié)果說(shuō)明,葉酸修飾的聚合物膠束可靶向輸送紫杉醇到腫瘤細(xì)胞內(nèi),并可降低抗癌藥物的毒副作用,在實(shí)體腫瘤的治療方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。DOMC-FA/(PTX+VRP)膠束對(duì)耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞顯示出比其它制劑強(qiáng)的毒性行為,這主要是因?yàn)槿~酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用和維拉帕米介導(dǎo)的P-糖蛋抑制作用的協(xié)同效果,因而,增強(qiáng)了紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的耐藥現(xiàn)象。說(shuō)明,DOMC-FA/(PTX+VRP)膠束是具有維拉帕米介導(dǎo)的P-糖蛋抑制和葉酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞的兩種機(jī)制結(jié)合的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的雙功能膠束系統(tǒng),其在多藥耐藥實(shí)體腫瘤的治療方面會(huì)有很好的治療效果。由小鼠體內(nèi)組織分布試驗(yàn)表明,小鼠尾靜脈注射Taxol注射液和DOMC-FA/PTX膠束后藥物在各組織器官的分布發(fā)生了改變。結(jié)果表明PTX制成DOMC-FA/PTX膠束后可明顯延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的平均滯留時(shí)間,具有明顯緩釋效應(yīng),有助于提高藥物的療效。靶向性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,與Taxol注射液相比PTX制成DOMC-FA/PTX膠束后體內(nèi)行為發(fā)生了明顯改變,相對(duì)攝取率re從高到低依次為脾8.29、肺3.82、肝1.78、血漿1.31、心0.62、腎0.35,顯示出明顯的脾和肺靶向。DOMC-FA/PTX膠束可靶向于肝臟,肝臟中藥物分布量占很大的給藥量,藥物蓄積于肝臟并形成藥物儲(chǔ)庫(kù)。數(shù)據(jù)表明,DOMC-FA/PTX膠束可極大提高藥物在脾臟和肝臟的分布,有助于肝脾疾病的臨床治療,且以肝脾為藥物儲(chǔ)庫(kù)緩慢釋放藥物；同時(shí)肺中分布與Taxol注射液相比顯著提高,且具有更強(qiáng)的滯留特性,對(duì)于PTX對(duì)肺中腫瘤疾病的治療具有重要的臨床意義；PTX的主要毒性在于骨髓抑制、心臟毒性和腎毒性,DOMC-FA/PTX膠束使PTX在心、腎的分布極大降低,心臟和腎臟毒性的減少對(duì)于PTX的臨床應(yīng)用具有重要意義。家兔體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明,Taxol-Sol和DOMC-FA/PTX膠束注射后其血藥濃度-時(shí)間曲線特征明顯不同。Taxol-Sol血藥濃度下降較快呈現(xiàn)出較陡的趨勢(shì),PTX在體內(nèi)很快的被清除；而DOMC-FA/PTX的血藥濃度曲線則更為平穩(wěn)、持久,血藥濃度在12h時(shí)仍能維持較高水平(0.23μg.ml-1)。兩種制劑均符合雙室模型特征,藥物動(dòng)力學(xué)方程分別為C=30.49e-2.634t+5.641e-0.616t,C=26.422e-1157t+8.213e-0.302t。通過(guò)比較藥動(dòng)學(xué)參數(shù)表可知,Taxol注射液的分布和消除均快于納米膠束組,DOMC-FA/PTX膠束的AUC值(53.217mg/L-h)明顯高于Taxol注射液的AUC值(23.288mg/L-h);納米膠束的MRT(1.913h)高于Taxol注射液的MRT(0.892h)；膠束的機(jī)體總清除率CL(0.158L/h/kg)小于Taxol注射液的機(jī)體總清除率CL(0.345L/h/kg)。說(shuō)明DOMC-FA/PTX納米膠束靜脈注射給藥后,可顯著延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間,具有緩釋和長(zhǎng)循環(huán)作用。
關(guān)鍵詞：腫瘤多藥耐藥； 葉酸偶聯(lián)的改性多糖； 功能性納米膠束； 紫杉醇； 維拉帕米；
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